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Une équipe de recherche collaborative du Wyss Institute de Harvard et de l’ETH Zurich en Suisse a identifié des “safe harbors” génomiques (GSH) dans la mer tumultueuse de la séquence du génome humain pour y déposer des gènes thérapeutiques. Dans le cadre de leur validation, ils ont inséré un gène rapporteur fluorescent GFP dans les GSH candidats et ont suivi son expression dans le temps. Les GSH pourraient permettre une expression plus sûre et plus durable des gènes dans les futures thérapies géniques et cellulaires. Cette illustration a valu à l’équipe la couverture du numéro de Cell Reports Methods dans lequel l’étude est publiée. Crédit : Erik Aznauryan
Des chercheurs du Wyss Institute de Harvard, de la Harvard Medical School et de l’ETH Zurich prédisent et valident les havres de sécurité génomiques pour les gènes thérapeutiques, permettant ainsi des thérapies géniques et cellulaires plus sûres, plus efficaces et plus prévisibles.
De nombreuses thérapies géniques et cellulaires futures destinées à traiter des maladies comme le cancer, des maladies génétiques rares et d’autres affections pourraient voir leur efficacité, leur persistance et leur prévisibilité renforcées par ce que l’on appelle les “ports génomiques sûrs (GSH)”. Il s’agit de sites d’atterrissage dans le génome humain capables d’accueillir en toute sécurité de nouveaux gènes thérapeutiques sans provoquer d’autres changements involontaires dans le génome d’une cellule qui pourraient présenter un risque pour les patients.
Cependant, il a été aussi difficile de trouver des GSH ayant un potentiel de traduction clinique que de trouver un site d’atterrissage lunaire pour un vaisseau spatial – qui doit se trouver sur un territoire lisse et accessible, pas trop escarpé et entouré de grandes collines ou falaises, offrir une bonne visibilité et permettre un retour en toute sécurité. De même, un GSH doit être accessible par les technologies d’édition du génome, exempt d’obstacles physiques tels que des gènes et d’autres séquences fonctionnelles, et permettre une expression élevée, stable et sûre d’un gène thérapeutique “débarqué”.
Jusqu’à présent, seuls quelques candidats GSH ont été explorés et ils sont tous accompagnés de certaines réserves. Soit ils sont situés dans des régions génomiques relativement denses en gènes, ce qui signifie qu’un ou plusieurs d’entre eux pourraient voir leur fonction compromise par un gène thérapeutique inséré dans leur voisinage, soit ils contiennent des gènes jouant un rôle dans le développement du cancer qui pourraient être activés par inadvertance. En outre, les GSH candidats n’ont pas été analysés pour vérifier la présence d’éléments régulateurs qui, bien que n’étant pas eux-mêmes des gènes, peuvent réguler l’expression des gènes à distance, ni pour savoir si les gènes insérés modifient les schémas globaux d’expression des gènes dans les cellules sur l’ensemble du génome.
Aujourd’hui, une collaboration de chercheurs du Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de Harvard, de la Harvard Medical School (HMS) et de l’ETH Zurich en Suisse, a mis au point une approche informatique permettant d’identifier les sites GSH présentant un potentiel nettement plus élevé pour l’insertion sûre de gènes thérapeutiques et leur expression durable dans de nombreux types de cellules. Pour deux des 2 000 sites GSH prédits, l’équipe a procédé à une validation approfondie avec des thérapies par cellules T adoptives et à une analyse de l’impact de ces thérapies. in vivo de thérapies géniques pour les maladies de la peau. En modifiant les sites GSH identifiés pour qu’ils portent respectivement un gène rapporteur dans les cellules T et un gène thérapeutique dans les cellules de la peau, l’équipe a démontré l’expression sûre et durable des gènes nouvellement introduits. L’étude est publiée dans Cell Reports Methods.
“Alors que les GSH pourraient être utilisés comme plateformes d’atterrissage universelles pour le ciblage des gènes, et ainsi accélérer le développement clinique des thérapies géniques et cellulaires, jusqu’à présent, aucun site du génome humain n’a été entièrement validé et tous ne sont acceptables que pour des applications de recherche”, a déclaré George Church, Ph.D., membre de la faculté centrale de Wyss et auteur principal de l’étude. “Cela fait de l’approche collaborative que nous avons adoptée pour obtenir des GSH hautement validés un important pas en avant. Associés à des outils d’intégration de gènes ciblés plus efficaces que nous développons en laboratoire, ces GSH pourraient permettre une variété de futurs efforts de traduction clinique.” M. Church est l’un des responsables de la plateforme de biologie synthétique de l’Institut Wyss. Il est également titulaire de la chaire Robert Winthrop de génétique à la HMS et professeur de sciences et technologies de la santé à l’Université de Harvard et au Massachusetts Institute of Technology (MIT).
Passer le génome au crible des GSHs
Les chercheurs ont d’abord mis en place un pipeline informatique qui leur a permis de prédire les régions du génome susceptibles d’être utilisées comme GSH en exploitant la richesse des données de séquençage disponibles à partir de lignées cellulaires et de tissus humains. “Dans ce balayage étape par étape du génome entier, nous avons exclu par calcul les régions codant pour les GSH.des protéines, y compris des protéines qui ont été impliquées dans la formation de tumeurs, et des régions codant pour certains types d’ARN ayant des fonctions dans l’expression des gènes et d’autres processus cellulaires. Nous avons également éliminé les régions qui contiennent des éléments dits “amplificateurs”, qui activent l’expression des gènes, souvent à distance, et les régions qui comprennent les centres et les extrémités des chromosomes afin d’éviter les erreurs de réplication et de ségrégation des chromosomes pendant la division cellulaire”, a déclaré le premier auteur, Erik Aznauryan, Ph.D. “Cela nous a laissé avec environ 2 000 loci candidats qui doivent tous être étudiés plus avant à des fins cliniques et biotechnologiques.”
Aznauryan a commencé le projet en tant qu’étudiant diplômé avec d’autres membres du laboratoire de Sai Reddy au département de science et d’ingénierie des biosystèmes de l’ETH Zurich avant de visiter le laboratoire de Church dans le cadre de ses études supérieures, où il a fait équipe avec Denitsa Milanova, Ph.D., boursière du programme de développement technologique Wyss. Il a depuis rejoint le groupe de Church en tant que boursier postdoctoral. Reddy, auteur principal de l’étude collaborative, est professeur associé d’immunologie systémique et synthétique à l’ETH Zurich et se concentre sur le développement de nouvelles méthodes en biologie systémique et synthétique afin de concevoir des cellules immunitaires pour diverses recherches et applications cliniques.
Sur les 2 000 sites GSH identifiés, l’équipe en a sélectionné cinq au hasard et les a étudiés dans des lignées cellulaires humaines communes en insérant des gènes rapporteurs dans chacune d’elles à l’aide d’une stratégie d’édition du génome rapide et efficace basée sur CRISPR-Cas9. “Deux des sites GSH ont permis une expression particulièrement élevée du gène rapporteur inséré – en fait, des niveaux d’expression significativement plus élevés que ceux obtenus par l’équipe avec le même gène rapporteur inséré dans deux GSH de génération antérieure. Il est important de noter que les gènes rapporteurs hébergés par les deux sites GSH n’ont pas régulé à la hausse les gènes liés au cancer”, a déclaré Aznauryan. Cela peut également devenir possible parce que des régions du génome éloignées les unes des autres dans le linéaire ADN linéaire des chromosomes, mais proches dans le génome tridimensionnel, dans lequel différentes régions de chromosomes pliés se touchent, peuvent être affectées conjointement lorsqu’un gène supplémentaire est inséré.
Eying clinical translation
Pour évaluer les deux sites GSH les plus convaincants dans les types de cellules humaines présentant un intérêt pour les thérapies cellulaires et géniques, l’équipe les a étudiés respectivement dans les cellules T immunitaires et les cellules de la peau. Les cellules T sont utilisées dans un certain nombre de thérapies cellulaires adoptives pour le traitement du cancer et des maladies auto-immunes qui pourraient être plus sûres si le gène codant pour le récepteur était inséré de manière stable dans un GSH. De même, les maladies de la peau causées par des mutations nuisibles dans des gènes contrôlant la fonction des cellules de différentes couches de la peau pourraient potentiellement être guéries par l’insertion et l’expression à long terme d’une copie saine du gène muté dans un GSH de cellules cutanées en division qui reconstituent ces couches.
“Nous avons introduit un gène rapporteur fluorescent dans deux nouveaux GSH de cellules T humaines primaires obtenues à partir du sang, et un gène entièrement fonctionnel. LAMB3 Nous avons introduit un gène rapporteur fluorescent dans deux nouveaux GSH dans des cellules T humaines primaires obtenues à partir du sang et un gène LAMB3 entièrement fonctionnel, une protéine extracellulaire de la peau, dans les mêmes GSH dans des fibroblastes dermiques humains primaires, et nous avons observé une activité durable”, a déclaré Milanova. Bien que ces GSH soient particulièrement bien placés pour améliorer les niveaux et la persistance de l’expression génétique dans les cellules mères et filles pour la thérapeutique, je suis particulièrement enthousiaste à l’idée d’améliorations cellulaires émergentes de type “gain de fonction” qui pourraient augmenter la fonction normale des cellules et des organes. L’aspect sécurité est alors d’une importance capitale.” Avec une équipe d’entrepreneurs du Wyss, Milanova développe une plateforme pour le rajeunissement et les améliorations génétiques, en mettant l’accent sur les points suivants le rajeunissement de la peau.
“Une analyse de séquençage approfondie que nous avons entreprise dans les cellules T humaines primaires modifiées par GSH a clairement démontré que l’insertion a un potentiel minime pour provoquer des effets de promotion des tumeurs, ce qui est toujours une préoccupation principale lors de la modification génétique des cellules à des fins thérapeutiques”, a déclaré Reddy. “L’identification de sites GSH multiples, comme nous l’avons fait ici, soutient également le potentiel de construction de thérapies cellulaires plus avancées qui utilisent des transgènes multiples pour programmer des réponses cellulaires sophistiquées, ceci est particulièrement pertinent dans l’ingénierie des cellules T pour l’immunothérapie du cancer.”
“Cet effort de collaboration interdisciplinaire démontre la puissance de l’intégration des approches computationnelles avec l’ingénierie du génome tout en maintenant l’accent sur la traduction clinique. L’identification des GSH dans le génome humain augmentera considérablement les efforts futurs de développement thérapeutique axés sur l’ingénierie de thérapies géniques et cellulaires plus efficaces et plus sûres”, a déclaré le directeur fondateur de Wyss, Donald Ingber, M.D., Ph.D., qui est également le directeur général de Wyss. JudahProfesseur Folkman de biologie vasculaireà la HMS et à l’hôpital pour enfants de Boston, et professeur de bio-ingénierie à l’école John A. Paulson d’ingénierie et de sciences appliquées de Harvard.
Référence : “Discovery and validation of human genomic safe harbor sites for gene and cell therapies” par Erik Aznauryan, Alexander Yermanos, Elvira Kinzina, Anna Devaux, Edo Kapetanovic, Denitsa Milanova, George M. Church et Sai T.Reddy, 14 janvier 2022, Cell Reports Methods.
DOI: 10.1016/j.crmeth.2021.100154
Les autres auteurs de l’étude sont Alexander Yermanos, Ph.D., et Edo Kapetanovic, membres du groupe de Reddy ; Anna Devaux de l’Université de Bâle, en Suisse ; et Elvira Kinzina du McGovern Institute for Brain Research du MIT. L’étude a été soutenue par des bourses de recherche de l’ETH, la Helmut Horten Stiftung et le Aging and Longevity-Related Research Fund de la HMS, ainsi que par une bourse d’innovation Genome Engineer 2019 de Synthego accordée à Aznauryan.
